石蜡包埋组织的免疫组织化学方案

1. 脱蜡水化

石蜡切片置于新鲜二甲苯中浸泡脱蜡3次，每次15 min；依次置于不同浓度（100%、95%、90%、80%、70%）乙醇浸泡各5 min，再置于蒸馏水洗涤5 min，重复3次。

2. 抗原修复

沸水浴修复：将100×抗原修复缓冲液（试剂2）用蒸馏水稀释成1×抗原修复缓冲液，放入修复盒中并提前加热至95-100℃（注意盖好以防液体蒸发），然后将切片放入修复盒中，在沸水浴环境中保持外沸状态15 min，室温自然冷却；用PBS缓冲液（试剂1，将干粉溶解在2L蒸馏水中）清洗5 min，重复3次。

3. 阻断内源性过氧化物酶

用吸水纸吸去玻片上多余的液体，用免疫组化笔在组织周围画圈，加入2-4滴内源性过氧化物酶阻断剂（试剂3），室温下置于湿盒中孵育15 min，用PBS洗涤5 min，重复3次。

4. 血清封闭

用吸水纸吸去玻片上多余的液体，加入2-4滴封闭工作液（试剂4），置于湿盒内37℃封闭20 min，以减少非特异性染色。

5. 一抗孵育

用吸水纸吸去玻片上多余的液体，加入2-4滴人Calbindin 兔多抗工作液（试剂5），置于湿盒中，4℃孵育过夜或37℃孵育1-2 h。

6. 复温

4℃孵育过夜后，室温下复温15 min (若在室温下孵育一抗，则直接进入下一步清洗)；用PBS洗涤5 min，重复3次。

7. 二抗孵育

用吸水纸吸玻片上多余的液体，加入2-4滴HRP标记羊抗兔IgG工作液（试剂6），置于湿盒中，37℃孵育1-2 h；用PBS洗涤5 min，重复3次。

8. 显色

用吸水纸吸去玻片上多余的液体，在每张切片上滴加约50 μL新配制的DAB工作液（试剂7:试剂8:PBS=1:1:18），作用3-5 min。显微镜下观察结果，达到合适的显色强度后，用蒸馏水冲洗切片以终止反应，用蒸馏水冲洗5 min，重复3次。

9. 复染

滴加适量复染试剂（试剂9）复染3-5 min，蒸馏水冲洗5 min，滴加盐酸酒精分化约30 s，蒸馏水洗涤5 min，重复2次。

10. 脱水封片

将玻片依次置于不同浓度（70%、80%、90%、95%、100%）乙醇，各5 min；然后置于新鲜二甲苯中浸泡脱蜡3次，每次15 min。用吸水纸吸去多余的二甲苯，滴加适量封片剂（试剂10）在组织上，将盖玻片盖在组织上，避免产生气泡。

注意事项

1. 建议检测时进行阴性及阳性对照，以提高实验的可靠性。

2. 本品中的配套试剂，请不要用其他生产商产品替换使用。

3. DAB为致癌物质，请采取必要的防范措施。

4. PBS洗涤液（试剂1）配制后在4℃可保存一周；抗原修复液（试剂2）及显色剂（试剂7和8）的工作液需每次实验时现用现配。

*5. 发表论文时引用本产品的写作建议 "IHC0106H, Bioss Antibodies"。引用示例: “Human tissue sections using Human Calbindin IHC Kit (IHC0106H, Bioss Antibodies) were stained for Calbindin according to the manufacturer's instructions.”