| 产品编号 | C6207 |
| 英文名称 | Animal Cell/Tissue Genome Extraction Kit |
| 中文名称 | 动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒 |
| 别 名 | 超强通用型基因组DNA提取试剂盒; |
| 保存条件 | 室温干燥可保存一年。. |
| 注意事项 | This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications. |
| 产品介绍 |
产品简介 本试剂盒适合于从新鲜或冷冻的动物组织（比如鼠尾、肝脏等），细胞，血液，细菌等多种样品中提取高纯度总DNA。本品可纯化获得分子量最大为50kb的DNA片段，纯化过程不需要使用苯酚或氯仿等有毒溶剂，无需乙醇沉淀。本试剂盒采用优化的缓冲体系使裂解液中的DNA高效特异的结合到硅基质离心吸附柱上，PCR和其他酶促反应的抑制剂可通过两步洗涤步骤被有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可得到高纯度DNA。纯化得到的DNA可以直接用于酶切，PCR，Real-Time PCR，文库构建，Southern Blot，分子标记等下游实验。 产品组份 Buffer GTL: 12 ml (50T) Buffer GL: 12 ml (50T) Buffer GW1（concentrate）: 13 ml (50T) Buffer GW2（concentrate）: 15 ml (50T) Buffer GE: 7 ml (50T) Proteinase K** : 1 ml (50T) Spin Columns DM with Collection Tubes: 50个 (50T) ** Proteinase K（蛋白酶K）：-20℃保存，开盖后防止空气及枪头污染，如果出现絮状 物，是因为溶解缓冲液中的钙离子在磷酸盐中可能会产生不溶解性沉淀，离心取上清，不影响使用效果。 自备试剂 无水乙醇；Enzymatic Lysis Buffer（提取革兰氏阳性菌基因组DNA时须准备）。 Enzymatic Lysis Buffer 配方：20 mM Tris，pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2％Triton X-100；终浓度为20mg/ml的Lysozyme（溶菌酶）。 实验前准备及重要注意事项 1. 样品应避免反复冻融，否则会导致提取DNA片段较小且提取量下降。 2. 如果提取次生代谢产物大量积累或细胞壁厚的细菌培养物的基因组，建议在对数生长期早期收集样品。 3. 第一次使用前应按试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。 4. 使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀，请将Buffer GL和Buffer GTL于56˚C水浴重新溶解。 5. 如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GL前加入4μl DNase-Free的RNase A（100mg/ml），RNase A 本试剂盒并未提供，可单独订购。 操作步骤 血液及细胞样本基因组提取 1. 材料处理 a) 如果提取材料为哺乳动物抗凝血液（无核红细胞），可直接向50-200μl新鲜或冷冻的抗凝血液样品中加入Buffer GTL补足至200μl。 b) 如果提取材料为禽类，鸟类，两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，取5-10μl新鲜或冷冻的抗凝血液样品，加入Buffer GTL补足至200μl。 c) 贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液（最大提取量为5x106个细胞），2000 rpm（400xg）离心5分钟，弃尽上清，加200μl GTL，振荡至样品彻底悬浮。 注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100mg/ml的RNase A 溶液，涡旋15秒，室温放置2分钟。 2. 加入20μl Proteinase K 溶液,混匀。 3. 加入200μl Buffer GL，涡旋振荡充分混匀，56˚C水浴10分钟。 4. 短暂离心以去除管盖内壁的水珠。加入200μl无水乙醇，涡旋振荡充分混匀，短暂离心。 注意： 1）加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。 2）加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。一些组织在加入BufferGL和无水乙醇后可能形成溶胶状产物，此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。 5. 上一个步骤中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm（约13,400 xg） 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 6. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 7. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7。 8. 12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。 9. 将吸附柱置于一个新的离心管（自备）中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000 rpm 离心1分钟，收集DNA溶液，-20˚C保存DNA。 注意： 1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。 2）Buffer GE在65-70˚C水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200 μl BufferGE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。 3）如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心1分钟；若洗脱体积小于200 μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 μg，推荐用50 μl Buffer GE或灭菌水洗脱。 4）因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20˚C保存。 动物组织基因组提取 1. 材料处理：如果提取材料为动物组织，取25 mg（脾组织用量应少于10 mg）；如果材料为鼠尾，取一段长度为0.4-0.6 cm的大鼠鼠尾或两段长度为0.4-0.6 cm的小鼠鼠尾。 a. 样本进行液氮研磨或切成小块后置于1.5 ml离心管中，加入180 μl Buffer GTL，将不同样品做好标记。 b. 若使用匀浆器处理样本，匀浆前向样本中加入不超过80 μl Buffer GTL，匀浆后加入100 μl Buffer GTL。 注意：1）确保各组织的量不要超出推荐范围。2）组织样本在加入Buffer GTL之前用液氮研磨或加入Buffer GTL用匀浆器匀浆处理，可以增加裂解效率。 2. 加入20 μl Proteinase K，涡旋震荡使样品彻底混匀。56˚C水浴，直至组织完全裂解，孵育过程中可每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样品分散。 注意：1）不同组织消化时间不同，通常1-3小时即可完成，鼠尾需要消化6-8小时，必要时过夜消化，不会影响后续操作。2）如果孵育和涡旋震荡后仍然有胶状物质，延长56˚C孵育时间或再加入20 μl Proteinase K消化。3）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl的浓度为100mg/ml的RNase A溶液，涡旋15秒，室温放置5-10分钟。 3. 加入200 μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，70˚C水浴10分钟。短暂离心后加入200 μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。 注意：1）加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。2）加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。一些组织（如脾，肺）在加入Buffer GL和无水乙醇后可能形成溶胶状产物，此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。 4. 短暂离心，将步骤3所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm（约13,400xg ）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 5. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 6. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm。离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤6。 7. 12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCR等）。 8. 将吸附柱置于一个新的离心管（自备）中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200 μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。 注意：1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。2）Buffer GE在65-70°C水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200 μl BufferGE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。3）如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心1分钟；若洗脱体积小于200 μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 μg，推荐用50 μl Buffer GE或灭菌水洗脱。4）因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20°C保存。 细菌基因组提取 1. 细菌样本预处理 1a. 革兰氏阴性菌 （1）取细菌培养物1-5 ml（106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞）置于离心管（自备）中，12,000 rpm（~13,400xg）离心1分钟，尽量吸净上清。 （2）向沉淀中加入180 μl Buffer GTL，振荡使菌体重悬。 （3）加入20 μl Proteinase K，涡旋混匀，56°C孵育，直至菌体完全裂解，孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样本分散。 注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4 μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10分钟。 （4）加入200 μl Buffer GL，涡旋震荡混匀。 1b. 革兰氏阳性菌 （1）取细菌培养物1-5 ml（106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞）置于离心管（自备）中，12,000 rpm离心1分钟，尽量吸净上清。 （2）加入180 μl Enzymatic Lysis Buffer（自备）使菌体重悬。 （3）37°C孵育30分钟。 （4）加入20 μl Proteinase K涡旋震荡，充分混匀。加入200 μl Buffer GL，涡旋震荡混匀。56℃孵育30分钟。 注意：1）如果需要，95°C孵育15分钟可以使病原体失活，但是95°C孵育会造成一些DNA的降解。2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4 μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10分钟。 2. 加入200 μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。 注意：加入无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。 3. 将步骤2所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入到已装入收集管的吸附柱（SpinColumns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 4. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 5. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤5。 6. 12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。 7. 将吸附柱置于一个新的离心管（自备）中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200 μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20°C保存DNA。 注意： 1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。 2）Buffer GE在65-70°C水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200 μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。 3）如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心1分钟；若洗脱体积小于200 μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 μg，推荐用50 μl Buffer GE或灭菌水洗脱。 4）因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。 |
| 1、抗体溶解方法 | |
| 2、抗体修复方式 | |
| 3、常用试剂的配制 | |
| 4、免疫组化操作步骤 | |
| 5、免疫组化问题解答 | |
| 6、Western Blotting 操作步骤 | |
| 7、Western Blotting 问题解答 | |
| 8、关于肽链的设计 | |
| 9、多肽的溶解与保存 | |
| 10、酶标抗体效价测定程序 | |
