发表者：北京博奥森生物      发表时间：2016-2-15

细胞凋亡是生物发育过程中或在正常生理状态下清除衰老及受损细胞的一种普遍现象。细胞凋亡的发生受胞外或胞内的多种刺激源所诱导，其中热休克蛋白（热激蛋白）是细胞凋亡的调控因子之一。 细胞是通过调节自身的防御系统来适应环境胁迫，并且根据胁迫程度的强弱，利用自身遗传机制或调控自身状态抵抗胁迫，或主动诱发细胞死亡。 细胞死亡有两种形式：细胞凋亡和细胞坏死。 细胞凋亡：是一种依赖于能量的、普遍存在的生理过程，受一些在进化上保守的基因所表达蛋白的调控。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)被认为是生物进化上最保守的蛋白家族之一，经研究表明，HSP与细胞凋亡关系密切，尤其是HSP70、HSP27对热激胁迫、氧化胁迫、电离辐射等引起的细胞凋亡具有保护作用。 一.热休克蛋白与细胞凋亡 细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主性死亡。它是指在一定的生理或病理条件下，有核细胞启动细胞内的特定程序(自身的遗传机制)，通过激活内源DNA内切酶，导致细胞自然死亡。细胞凋亡的特点在于特异的形态和生理变化：形态上的变化包括细胞收缩、质膜出现孔隙、细胞核浓缩和胞体自行分割成许多由膜包裹的超微结构完整的细胞体，称凋亡小体(apoptotic body) ；而生理上的变化包括核DNA的断裂，以及caspases (cysteine as-partate-specific protease)活化后生成了被部分消化的蛋白水解产物。 细胞凋亡是一个高度精确调节的过程，它首先对初始的刺激产生响应，尔后在一些激酶和调节因子的作用下发生一系列级联反应。 细胞凋亡过程大体可以分为三个阶段： (1)起始阶段(或信号感应阶段)，包括细胞表面死亡受体的激活，主要是肿瘤坏死因子(TNF)家族成员 ； (2)信号转导阶段(或准备阶段)，包括caspases感应器和特定激酶/磷酸酶的活化； (3)执行阶段(或死亡阶段)，主要是caspases效应器的活化。对细胞凋亡的调节主要发生在信号转导通路的交叉处。 　 表达热休克蛋白是细胞受高温胁迫后在分子水平上最主要的响应之一。 根据相对分子质量大小，热激蛋白可被分为五个保守的家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和sHSPs(相对分子质量约1.6×104－4.2×104)。 热休克蛋白是细胞中一种重要的调节蛋白，细胞的许多生理机能，如细胞增殖、细胞周期的维持等，都与热激蛋白有关。 热休克蛋白的另一重要生理功能是保护细胞抵抗环境胁迫。通常认为热休克蛋白可以通过阻止蛋白质的变性以及促使变性蛋白复性，保护胁迫条件下的细胞少受损伤。 近年来的研究表明，热休克蛋白家族的重要成员，如HSP90、HSP70、HSP27等，通过介入细胞凋亡信号转导通路而直接影响细胞凋亡，它们作为细胞凋亡调控的关键因子发挥了重要作用。 二.热休克蛋白对caspase依赖型细胞凋亡的调节作用 caspases是一类蛋白裂解酶，在细胞内以无活性的酶原(procaspases)形式存在，当作用于胞内特异性底物后引起细胞凋亡。Thornberry和Lazebnik[1]报道的caspases大约有14种，可以分为三个类群：起始、激发和效应caspases。在不同的细胞凋亡途径中，caspases的激活是一个级联反应。通过caspase级联，细胞可将凋亡信号逐级放大和整合。 热休克蛋白在caspase依赖型细胞凋亡的调节过程中扮演了十分复杂的角色。一方面，由于热激蛋白对细胞的保护功能，它们抑制细胞凋亡；另一方面，它们又作为一种关键的信号蛋白分子伴侣而直接地促进了细胞凋亡。我们将通过细胞凋亡信号通路的不同起始位点，来阐释热休克蛋白是如何在调节细胞凋亡的过程中发挥双重作用的。 A. 起源于原生质膜的凋亡信号及HSP的调控：　原生质膜上细胞凋亡起始阶段的主要参与者是死亡受体，例如Fas(Apo-1/CD95)受体家族。Fas受体是TNF受体超家族的一个成员，在多种细胞、组织(主要是免疫细胞)中广泛表达。该受体为跨膜蛋白，包括富含半胱氨酸的胞外区和胞内的死亡结构域。当Fas受体结合于其抗体或同源配体后，可以诱导一些蛋白的磷酸化，并触发细胞凋亡。FADD(Fas-死亡结构域接合蛋白)和接头蛋白Daxx，是两个下游的接合蛋白，分别介导了两个独立的细胞凋亡信号转导通路。 HSP家族成员在Fas “死亡受体”通路中发挥了重要的作用。接头蛋白Daxx从细胞核到胞质的定位是其促进细胞凋亡所必需的一个环节，磷酸化的HSP27通过封闭Daxx与细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulating kinase1，ASK1)之间的相互作用阻止了这种形式的转运，从而抑制了Fas-介导的细胞凋亡。HSP90协助来自原生质膜的细胞凋亡信号的转导，促进死亡结构域激酶以及受体相关蛋白的活化，从而使细胞对TNF诱导的细胞凋亡十分敏感。此外，HSP90的同体蛋白——HSP75/TRAP-1与TNF受体发生互作，可能促进了TNF的信号转导。 在执行阶段的晚期，细胞凋亡的特征是细胞形态的显著变化，包括膜破裂形成囊泡状结构，以及磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)暴露于膜的表面。HSP参与了膜囊泡的形成：有学者认为：HSP27作为一种帽结合蛋白与F-肌动蛋白形成了HSP27-F-肌动蛋白环，起到了分割膜囊泡的作用。细胞丧失原生质膜磷脂的不对称性导致PS暴露于原生质膜的外层，HSP在PS表面化的过程中所起的作用尚不清楚，但表面化的PS可被免疫系统所识别，其中的HSP90类似物——Grp94协助了识别作用的发生。 B.　起源于细胞溶质的凋亡信号及HSP的调控　在细胞溶质中，应激激酶是调节细胞凋亡信号转导通路的重要元件。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-acti-vated protein kinases，MAPKs)是真核细胞介导细胞反应的重要信号系统，c-Jun NH2末端激酶(c-JunN-terminal kinase，JNK)是其中的一员，与细胞凋亡通路中一些分子的修饰有关，如JNK介导的对Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员——Bcl-2和Bcl-XL的磷酸化作用，可以抵消它们的部分功能，促进了细胞色素c从线粒体的释放，而细胞色素c作为胁迫传感器(stress sensor)被释放到胞质中，可以引发细胞执行凋亡程序。另一种应激激酶ASK1是一种丝裂原-活化的蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)，能够将JNK磷酸化并引发细胞凋亡响应。 HSP70在应激激酶通路中具有普遍的抑制作用。HSP72是ASK1的直接抑制剂：体外实验证明HSP72与ASK1激酶可发生物理相互作用，HSP72的表达抑制了H2O2-介导的ASK1的活化以及随后发生的NIH 3T3细胞的凋亡。CHIP(HSP70-互作蛋白的C-末端结构)通过抑制ASK1的活性，削弱了氧化胁迫中依赖于ASK1的细胞凋亡[11]。HSP72也直接地与JNK的多肽结合域发生互作，通过反义RNA的方法证明了HSP72的积累导致了JNK表达水平的下降[12]。HSP70家族的另一个成员——HSP105α在神经元PC12细胞中组成型表达，也通过抑制JNK的活性保护细胞抵御胁迫诱导的细胞凋亡。 HSP90是很多激酶折叠和活化所必需的蛋白。HSP90-Raf1复合体的解离诱导了JNK的活化，并引发了杆状细胞和B-淋巴细胞凋亡的发生。 C.起源于细胞核的凋亡信号及HSP的调控　细胞核内DNA的断裂是细胞凋亡的一种生化特征，是由于特异的核酸内切酶活化后将染色质切割成较短的DNA片段。但是，DNA的损伤也可能是一个细胞凋亡级联反应的早期信号转导事件， 经研究认为：当DNA发生断裂后，组蛋白H1.2转运至细胞质，通过激活Bcl-2蛋白-Bak，促进了细胞色素c的释放。 HSP在保护细胞免受各种胁迫刺激所导致的DNA损伤的过程中起到了主要的作用。胁迫发生后，大多数HSP都转运至细胞核，其中HSP27和HSP70家族成员主要在细胞抵抗氧化胁迫所造成的DNA损伤中起保护作用，过量表达HSP25可以降低TNF-α处理所造成的氧化性DNA损伤。小部分的HSP90在胁迫发生后也转运至细胞核，HSP90紧密地结合于组蛋白，诱发了染色质的压缩凝聚，从而避免了DNA受到严重损伤。 DNA损伤的一种相当特异的形式与端粒的缩短伴随发生。染色体末端端粒区的临界长度大约为7kb时，细胞进入衰老状态，有可能进一步发生细胞凋亡。端粒酶负责合成和维持端粒区的长度。HSP90直接与端粒酶发生互作，协助了其酶活性的发挥，经研究证明，HSP90能够增强前列腺癌细胞中端粒酶的活性。 D.　起源于线粒体的凋亡信号及HSP的调控　线粒体是细胞凋亡事件的中枢协调者，许多细胞凋亡信号转导通路汇集于线粒体，引发了线粒体膜的渗漏。经线粒体介导的凋亡信号通路其重要特征是凋亡小体的形成：细胞色素c从线粒体的释放驱动了相对分子质量较大的caspase活化复合物装配成凋亡小体。凋亡小体中寡聚化的细胞凋亡激活因子-1(apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1)，在dATP和caspase-9存在的条件下发生聚集，促进了细胞凋亡执行蛋白caspase-3的自我切割活化。研究表明，HSP家族成员在线粒体介导的细胞凋亡通路的调节过程中发挥了重要的作用。 专家们通过免疫共沉淀实验证明，HSP27与细胞色素c和caspase-3酶原相螯合，阻止了凋亡小体复合物的正确形成以及其功能的执行。实际上，HSP27结合于从线粒体释放入胞质的细胞色素c，阻止了细胞色素c-介导的Apaf-1与caspase-9酶原的互作，从而特异的干扰了caspase依赖型细胞凋亡的线粒体通路。这些结果说明了HSP27的表达维持了凋亡活化过程中的线粒体功能。 线粒体HSP60以及它的协同分子伴侣——HSP10，能够与caspase-3酶原发生互作，诱导细胞色素c的释放，从而促进了Jurkat细胞的凋亡的发生。与之相反的是，也有学者证明胞质HSP60可以与多种抗细胞凋亡分子(如Bax或Bak)相螯合，协助它们执行功能，这说明HSP60在凋亡调节过程中发挥了双重的作用。 在体外，用纯化的HSP70进行实验证明了它对细胞色素c/dATP-介导的caspase的活化具有抑制作用，但不抑制Apaf-1的寡聚化，HSP70通过直接与Apaf-1缔和而阻止了功能性凋亡小体的形成，抑制了细胞凋亡过程。相反，在小鼠胚胎F9细胞中过量表达HSP70同系物——HSP105α，能够诱导细胞凋亡的发生。 HSP90直接与Apaf-1结合，阻止了凋亡小体复合物的形成。除此之外，HSP90表面的活性半胱氨酸，可以降低细胞色素c的水平，表明HSP90在调节细胞氧化还原平衡的过程中起着重要的作用。 线粒体是活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成的原初位点，是体内ROS的主要产生源。在一个正常细胞中，通常存在一个促氧化和抗氧化通路之间的平衡。当受胁迫刺激后，氧化还原环境失衡，导致了ROS的积累。ROS作为细胞损伤的信使，可以通过氧化膜脂、蛋白和DNA引起细胞的普遍损伤。ROS的过度产生与许多形式的细胞凋亡和坏死相关联。 ROS的产生和HSP的诱导表达之间具有相关性。小分子热休克蛋白通过增强葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性以及轻微地激活谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽转移酶提高了还原型谷胱甘肽(GSH)的水平，而在多种氧化胁迫刺激下，GSH被排到细胞外环境，被认为是引发细胞凋亡的分子开关。HSP70家族成员在抵抗氧化胁迫过程中起到了与小分子热激蛋白类似的作用。例如在小鼠组织细胞中表达HSP70，可以通过抑制ROS的诱导抵御热诱导的细胞凋亡作用。 E.　起源于内质网的凋亡信号及HSP的调控　内质网(endoplasmic reticulum，ER)是蛋白质合成和运输的主要场所。许多胁迫条件包括细胞内稳态平衡的破坏、ER腔内氧化环境的改变等，都能引起内质网胁迫(ER stress)并导致细胞凋亡的发生。ER至少参与了细胞凋亡过程中的两个机制：未折叠蛋白反应和Ca2+信号传输的中断。研究表明，ER蛋白酶、caspase-7和-12参与了ER胁迫-介导的细胞凋亡。未折叠蛋白反应诱导了CHOP/GADD153转录因子的活化，后者也促进了ER-诱导的细胞凋亡。 ER胁迫会诱导内质网内分子伴侣葡萄糖调节蛋白(Glucose-regulated protein) Grp78的表达。Grp78参与了多肽的跨膜转运，作为一种细胞凋亡调节剂保护宿主细胞抵抗ER胁迫-介导的细胞凋亡。体外实验证明，Grp78抑制了细胞色素c-介导的caspase的活化并进而抑制了caspase-介导的细胞凋亡。但内质网内的热激蛋白在ER胁迫-介导的细胞凋亡中的作用还不清楚。 此外，在细胞凋亡过程中发现了ER与线粒体之间有明显的相互作用。这种相互作用涉及两个细胞器的接合处，使促细胞凋亡和抗细胞凋亡分子例如Bcl-2调节钙离子在接合处的流通成为可能。两种促细胞凋亡线粒体分子——Bax和Bak，被证明定位于ER并促进了caspase-12依赖型细胞凋亡。是否ER热休克蛋白也参与了对ER/线粒体连接的调节尚不清楚。 三.热休克蛋白对caspase-非依赖型细胞凋亡的调节作用 caspase-非依赖型细胞凋亡通路主要包括了丝氨酸蛋白酶类、组织蛋白酶类、钙激活中性蛋白酶类以及神经酰胺-介导的细胞凋亡，这些通路并不是以caspase的活化为中心。显然，细胞凋亡的各种信号转导通路是相互关联的，因此，“caspase-非依赖型”通路可能又与caspase-依赖型通路发生交叉。目前，对HSP在这些通路中发挥作用的研究还不多，实验证据也有限，例如已证明HSP27可以与胞质溶解产物中的丝氨酸蛋白酶A发生共沉淀。HSP70在肿瘤细胞表面表达，可以通过结合并摄取丝氨酸蛋白酶B而诱发肿瘤细胞的凋亡。此外，进一步证明HSP70对神经酰胺-介导的细胞凋亡有抑制效应。对此领域还有待进一步的深入研究。 四.热休克蛋白在细胞凋亡过程中的多效性 从死亡受体或细胞内胁迫传导出的死亡信号诱导了各种细胞凋亡分子的低聚反应和自身活化，在这些过程中都有HSP的广泛参与。细胞凋亡级联反应中各成员之间高度动态的交互作用，例如受体二聚化，caspase酶原/caspase在受体复合物的募集，dATP/细胞色素c/Apaf-1/caspase-9复合物的形成等，在大多数情况下，都受HSP的影响。作为蛋白的装配、转运和折叠的中枢调节器，HSP在细胞凋亡信号转导事件中起到了主要的调节作用。但是，它们的促细胞凋亡功能是受制约的，通常被HSP对细胞的保护作用所超越。这种微调平衡不仅是调节细胞死亡或生存的关键，而且是两种形式的细胞死亡，即细胞凋亡和细胞坏死之间的转换中枢。 总之； HSP热休克蛋白参与了细胞内的多种生理生化过程，是决定细胞命运的重要蛋白。它们是细胞的“中枢协调者”，对物理、化学和环境胁迫反应迅速且无处不在，共同作用来调节细胞的增殖、生存和死亡。HSP是细胞凋亡作用的重要调节者，参与并调控了细胞凋亡的各个事件，发挥了抗细胞凋亡或促细胞凋亡的作用，当然，对热休克蛋白在某些领域还有待更进一步的深入研究。 摘自《生命科学》08-06-02