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成功研发“抗人禽流感A核蛋白、禽流感B核蛋白单克隆抗体”-北京博奥森生物技术有限公司
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成功研发“抗人禽流感A核蛋白、禽流感B核蛋白单克隆抗体”
发表者:北京博奥森生物      发表时间:2016-2-15
我公司近期,在全体博奥森研发人员的通力合作下,成功研发制备了“小鼠抗人禽流感A核蛋白、禽流感B核蛋白单克隆抗体”为科研人员提供有力,方便的研究工具。 禽流感的发病机理及流行病学简介 人禽流行性感冒(以下称人禽流感)是由禽甲型流感病毒某些亚型的毒株引起的急性呼吸道传染病 1.引起禽流感(AI)的病原是禽流感病毒(AIV)该病毒属正粘病毒科流感病毒属 (1) 正粘病毒科的特征:正粘病毒和副粘病毒科的病毒有许多相同的特征均具有神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)可凝集某些动物的红细胞;对呼吸道系统都有致病性等特别是这两种病毒对粘多糖和糖蛋白具有特殊的亲合力尤其是对细胞表面的含唾液酸的受体具有更强的亲合力 正粘病毒科中只有一个属即流感病毒属根据流感病毒核蛋白(NP)和基质蛋白(MS)抗原性的不同将其分为ABC三个血清型它们之间抗原的差别可通过琼脂扩散试验补体结合试验等测出ABC三型流感病毒除了其核蛋白及基质蛋白抗原性不同外还有以下不同的生物学特性 (2) A型流感毒除有可能感染人外还感染许多其他种属的动物如马猪禽类海豹等而B型则主要感染人但C型也可从猪分离到(2)A型流染病毒的表面糖蛋白比B型和C型的具有更高的变异性(3)形态特征和分子生物学特征方面A型和B型都具有8个核酸片段而C型的基因组只有7个片段 根据流感病毒血凝素HA和神经氨酸酶NA抗原性的差异又可将其分为不同的亚型目前A型流感病毒有15种特异的HA和9种特异的NA (3)禽流感病毒毒株分类:AIV的毒株分类基于HA和NA亚型目前已发现15种血凝素HA和9种神经氨酸酶NA所有这些都是从禽流感分离物中以不同的组合鉴定出来的为了鉴定病毒的HA和NA要应用一组对不同亚型特异的抗血清对分离物进行血凝抑制(HI)和神经氨酸酶抑制(NA)试验;属于同一亚型病毒的比较常用鸡和雪豹感染后的血清及单克隆抗体进行应用单克隆抗体能较细致地比较同种或不同种动物中出现的相关病毒之后通过HI酶联免疫吸附试验(DLISA)和中和试验对病毒进行比较 (4) 命名:针对AIV的命名1971年提出了流感病毒命名的标准体系1980年又进行了修订一株流感病毒的名称包括型(AB或C)宿主来源(除人外)地理来源毒株编号(如果有)和分离的年代后面及圆括号内附以HA(H)和(N)的抗原性说明 2 . 人禽流感形态学特征: AIV粒子一般为球形直径为80~120纳米但也常有同样直径的丝状形态长短不一病毒粒子表面有10~12纳米的密集钉状物或纤突覆盖病毒囊膜内有螺旋形核衣壳两种不同形状的表面钉状物是HA(棒状三聚体)和NA(蘑菇形四聚体) HA的作用是将病毒粒子吸附在细胞表面受体(唾液酸低聚糖)上并与病毒的血凝活性相关在对病毒的中和作用和抗感染保护中抗HA抗体非常重要;NA酶的活性则是通过对受体内神经氨酸的作用可使新生病毒从细胞中释放出来抗NA抗体对保护作用也很重要 现已确定血凝集H2HA和神经氨酸N2及N9NAS的三维结构并明确了重要的抗原区域或表位 HA和NA以及被称为M2的小蛋白都包埋在宿主细胞质膜衍生的脂质囊膜中病毒囊膜下为主要结构蛋白M1位于RNA分子的周围与分子蛋白NP和三种大蛋白(PB1PB2和PA)负责 RNA复制和转录 病毒基因组由8个负链的单链RNA片段组成这8个片段编码10个病毒蛋白其中8个是病毒粒子的组成成分(HANANPM1M2PB1PB2和PA)分子质量最小的RNA片段编码两个非结构蛋白NS1和NS2NS1与胞浆包含体有关但NS1和NS2的功能尚不清楚,现在已经获得了包括H3H5和H7在内几个禽亚型号HA基因的全部序列以及所有14个血凝素基因的部分序列 3.病毒的化学组成: 流感病毒粒子大约由0.8%~1.1%的RNA70%~75%蛋白质20%~24%的脂质和5%~8%的碳水化合物组成脂质位于病毒的膜内大部分为磷脂还有少量的胆固醇和糖脂几种碳水化合物包括核糖(在RNA中)半乳糖甘露糖墨角藻糖和氨基葡糖在病毒粒子中主要以糖蛋白或糖脂的形式存在,病毒蛋白及潜在的糖基化位点是病毒基因组特异的但与病毒膜的糖蛋白或糖类链的脂质和碳水化合物链的成分是由宿主细胞确定的. 4.病毒复制: 病毒吸咐在细胞表面含唾液酸的糖蛋白受体上然后通过受体介导的细胞内吞作用病毒进入细胞这包括暴露于核内体内的低pH导致HA的构象改变介导膜融合这样核衣壳便进入胞浆并移向胞核流感病毒利用独特的机理转录启动转录时病毒的核酸内切酶从宿主细胞的mRNA上切下5′帽子结构并以此作为病毒转录酶进行转录的引物产生出6个单顺子的mRNA并转译成HANANP和三种聚合酶(PB1PB2和PA)NS和M基因的mRNA进行拼接每一个产生出两个mRNA依不同阅读框架进行转译产生NS1NS2M1和M2蛋白HA和NA在粗面内质网内糖基化在高尔基体内修饰然后运输到表面植入细胞膜中HA需要宿主细胞蛋白酶将其裂解成HA1和HA2但两者仍以二硫键相连这种裂解可生成传染性病毒并以出芽方式从质膜排出细胞. 5.抗原性变异: 流感病毒抗原性变变的频率很高主要以两种方式进行:漂移和转变抗原漂移可引起HA和/或NA的次要抗原变化而抗原转变可引起HA和/或NA的主要抗原变化; (1)抗原性漂移:抗原性漂移是由编码HA和/或NA蛋白的基因发生点突变引起的是在免疫群体中筛选变异体的反应它可引起致病性更强病毒的出现 (2)抗原性转变:抗原性转变是当细胞感染两种不同流感病毒时病毒基因组的片段特性允许发生片段重组从而引起转变它有可能产生256种遗传学上不同的毒力各异的子代病毒 6.对理化因素的抵抗力: A型流感病毒是囊膜病毒对去污剂等脂溶剂的灭活性比较敏感福尔马林β-丙内酯氧化剂稀酸乙醚去氧胆酸钠羟胺十二烷基硫酸钠和铵离子能迅速破坏其传染性禽流感病毒没有超常的稳定性因此对病毒本身的灭活并不困难病毒可在加热极端的pH值非等渗和干燥的条件下失活 在野外条件下流感病毒常从感染禽的鼻腔分泌物和粪便中排出病毒受到这些有机物的保护极大地增加抗灭活的抵抗力此外流感病毒可以在自然环境中特别是凉爽和潮湿的条件下存活很长时间粪便中病毒的传染性在4℃条件下可以保持长达30~50天20℃时为7天 7.禽流感病毒的致病力及毒力: 禽流感病毒致病力的变化范围很大流感病毒感染引发的疾病可能是不明显的或是温和的一过性的综合征甚至是100%发病率和/或死亡率的疾病疾病的症状可能表现在呼吸道肠道或生殖系统并随病毒种类动物种别龄期并发感染周围环境及宿主免疫状态的不同而不同禽流感病毒的毒力主要决定于病毒粒子的复制速率和血凝素蛋白裂解位点附近的氨基酸组成 目前国际上一般按欧共体规定的静脉内接种致病指数(IVPI)来判定毒力当IVPI>1.2时则认为是高致病力毒株。
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