一、蛋白免疫印迹(Western Blot)技术概览
蛋白免疫印迹(Western Blot，以下简称WB)是利用特定抗体能够专一结合其抗原“蛋白质”的原理来对样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达或修饰水平的免疫检测技术。
一般我们使用WB 都是为了半定量检测某种目的蛋白的相对表达量，通常要以表达相对稳定的蛋白作为内部对照（内参），然后采用“灰度分析软件”检测目的蛋白及内参条带的表达强度，每组目的蛋白分别以内参作为对照进行比对和相对定量，以使实验结果更加准确。同时，同一批样品至少进行技术重复三次，然后方可进行统计学分析。WB灵敏度可达ng级，用ECL显色法理论上可达pg级。
二、蛋白免疫印迹(WB)实验所需仪器、材料及试剂
（一）主要实验仪器
制冰机、超声破碎仪、低温冷冻离心机、蛋白电泳/转膜仪、多功能酶标仪、LI-COR Odyssey成像系统
（二）主要实验试剂与材料
15ml离心管、玻璃组织研磨器、EP管、冰浴、蛋白抽提试剂(改进型RIPA配方，Bioss产品货号C05-01001)、蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)、BCA蛋白定量试剂盒(Bioss产品货号C05-02001)、30%丙烯酰胺-N ,N-亚甲基双丙烯酰胺混合液(29:1)(Bioss产品货号C05-03004)、10%过硫酸铵(APS)(Bioss产品货号C05-03009)、四甲基乙二胺(TEMED)(Bioss产品货号C05-03008)、4×蛋白上样缓冲液(Bioss产品货号C05-03015)、蛋白Marker(Bioss产品货号C05-090006)、电泳缓冲液(Bioss产品货号C05-03010)、转膜缓冲液(Bioss产品货号C05-05003)、考马斯亮蓝染色液(Bioss产品货号C05-04001)、TBST缓冲液(pH7.4)(Bioss产品货号C5049)、PVDF膜(Bioss产品货号C55008)或NC膜(0.22µm)(Bioss产品货号C05-05002)、丽春红染色液(Bioss产品货号C05-04002)、脱脂奶粉(Bioss产品货号C5059)、牛血清白蛋白(BSA)、目的蛋白一抗、WB一抗稀释液(Bioss产品货号C05-07001)、HRP标记二抗(bs-0295G-HRP或bs-0296G-HRP)或荧光标记二抗(Bioss内部操作流程选用荧光二抗，Bioss产品货号bs-40295G-IRDye8或bs-40296G-IRDye8)、WB二抗稀释液(Bioss产品货号C05-07002)、ECL发光液(Bioss产品货号C05-07004)、膜再生液(Bioss产品货号C05-03041)
Western Blot操作流程图及Bioss相关配套试剂
三、蛋白免疫印迹(WB)实验标准操作流程和技术要点
（一）蛋白提取
● 组织样品蛋白提取方法
1. 用灭菌（预冷）的工具分离新鲜目的组织50mg-100mg，并用生理盐水或PBS洗涤干净，用洁净的剪刀将组织剪碎至合适大小。
2. 将剪碎的组织转移到玻璃研磨器中，加入适量的含有蛋白酶抑制剂（必要时还需要加入磷酸酶抑制剂）的RIPA（按照每20mg组织加入150-250µl裂解液的比例加入裂解液），置于冰上研磨2-5min，直到看不到明显的大的细胞团块，然后在冰浴裂解30min，让组织细胞充分裂解；可取少量裂解后组织液滴于载玻片，盖上盖玻片进行光镜下观察确认是否裂解充分。
3. 注：RIPA裂解液有（中）和（强）裂解强度两种，可以根据组织类型进行调整，以提高裂解效率。
4. 超声处理 10–15s，以完成细胞裂解并剪切 DNA，以降低样品粘度和提升蛋白溶解度。
注意：为确保组织细胞充分裂解，建议进行超声破碎。调节超声仪至适宜频率与功率（超声功率不宜过大，并设置超声间歇，以防止超声探头过度产热），将超声探头置于样本裂解液中部，但不触碰管壁或管底，进行冰浴超声。
超声循环设置如下：
超声3s，暂停10s，重复3-5次。
5. 超声处理后将样品继续置于冰上孵育30min。
6. 将上述裂解后样品，于4℃，12 000rpm，离心15-20min，取上清到一个新的EP管，置于冰上备用。
● 细胞样品蛋白提取方法
1. 对于贴壁细胞：从培养物中吸出培养基，用 1× PBS 洗涤细胞后，加入含有蛋白酶抑制剂（必要时还要加入磷酸酶抑制剂）的RIPA裂解液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞，然后立即从板上刮下细胞并将提取物转移至EP管，置于冰上。
2. 对于悬浮细胞：将悬浮细胞连同培养基转移到15ml离心管，室温1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，然后加入含有蛋白酶抑制剂（必要时还要加入磷酸酶抑制剂）的RIPA裂解液(6 孔板每孔100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)，用加样器吸打几次后转入一个新的EP管，置于冰上来裂解细胞。
3. 超声处理 10–15s，以完成细胞裂解并剪切 DNA，以降低样品粘度和提升蛋白溶解度。
注意：为确保组织细胞充分裂解，建议进行超声破碎。调节超声仪至适宜频率与功率（超声功率不宜过大，并设置超声间歇，以防止超声探头过度产热），将超声探头置于样本裂解液中部，但不触碰管壁或管底，进行冰浴超声。
超声循环设置如下：
超声3s，暂停10s，重复3-5次。
4. 超声处理后将样品继续置于冰上孵育30min。
5. 将上述裂解后样品，于4℃，12 000rpm，离心15-20min，取上清到一个新的EP管，置于冰上备用。
（二）蛋白定量
1. 配制工作液: 根据标准品和样品数量，按体积比 A : B (50 : 1)配制适量 BCA 工作液，充分混匀。BCA 工作液室温 24 小时内稳定。
2. 稀释标准品：取 10 微升标准品用 PBS 稀释至 100ul（标准品一般可用 PBS 稀释），使终浓度为 0.5mg/ml。将标准品按 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20ul 加到 96 孔板的蛋白标准品孔中，加 PBS 补足到 20ul。
3. 将稀释后（一般稀释5倍）的适当体积样品加入96 孔板的样品孔中，补加 PBS 到 20ul。
4. 各孔加入 200ul BCA 工作液，37℃放置 30 分钟。
5. 将96孔板冷却到室温，用酶标仪 562nm 测定 OD 值，根据标准曲线计算出蛋白浓度，理想的蛋白浓度应为1-5 µg/µl。
注意：对于过高的样品浓度，我们建议将样品用RIPA裂解液进行合理稀释并充分混匀后，再进行一次浓度测定为宜。
（三）电泳上样样品的制备
1. 在上样前，建议用提取样品用的RIPA裂解液将制备的组织、细胞蛋白样品的浓度统一调整为相同浓度并充分混匀，最好都在3-5µg/µl。
2. 上样量为20-40µg(如果是纯蛋白，上样量为100ng)，根据上样量计算好体积，每管样品分别与4×蛋白上样缓冲液按体积比1:3混匀。
3. 煮沸5-10min，使样品还原变性，然后立即放于冰上备用。
4. 对于剩余的样品，可以统一加入4×蛋白上样缓冲液后，将样品在-20℃或-80℃保存。
（四）电泳
1. SDS-PAGE凝胶的制备
根据要检测的目的蛋白分子量范围，参考下表选择合适的分离胶浓度灌制分离胶，加入保护层（可小心加入0.5ml去离子水封压胶面）。待分离胶凝固后，倒出保护层的去离子水，再灌注浓缩胶。根据样品数量和体积，选择合适的梳子插入浓缩胶。待浓缩胶完全凝固后，小心拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内。
2. 蛋白上样与电泳
将上述变性处理后的样品低速短暂离心后，按照实验设计的上样顺序，分别加入样品孔中。最后，加入合适的预染蛋白Marker。浓缩胶恒压80V，分离胶150V电压条件下电泳，直至指示剂溴酚兰迁移至凝胶底部。
电泳合格标准：目的蛋白条带位于分离胶的中部，并且条带充分分离。
（五）考马斯亮蓝染色（备选步骤）
在进行正式实验前，对于刚刚制备的蛋白样品，可取少量上样电泳后，把整张胶用考马斯亮蓝染色进行初步鉴定，以确定样品的质量。然后，再进入正式实验。
（六）蛋白转膜（湿转法）
原理：蛋白因结合SDS而带负电荷，在电场中从胶转移至膜上。
1. 将PVDF膜在无水甲醇中浸泡1-3min，再孵育于冰冷的电转缓冲液中5min。胶也可以在转膜液中平衡3-5min，防止转膜时条带变形。
2. 制作转膜“三明治”
湿式转膜三明治排列顺序：海绵/吸水纸/胶/膜/吸水纸/海绵，全部紧密排列，特别是胶与膜之间不能留有气泡
三明治安装的方向：负极与胶同侧，向正极方（膜）迁移。
膜的面积：5.2 * 8.4 cm
滤纸的面积：4条边均略长于膜的4条边。，
3. 200-300mA恒流转膜，转膜时间可参考下表。
（七）转膜后蛋白染色（备选步骤）
将膜置于丽春红工作液中，在室温下摇动1-5min，待蛋白带显示，后用TBST或超纯水洗膜，直至洗净膜上丽春红。
（八）膜的封闭
封闭的作用：为避免作为检测试剂的特异性一抗与膜发生非特异性结合而造成背景提高，需要对膜上的潜在非特异性结合位点进行封闭处理。
封闭条件：用TBST溶解的5%的脱脂奶粉或5%的BSA（建议提前配制，使奶粉或BSA充分溶解），室温封闭1h。
另外，需注意膜封闭的一些特殊情况：
● 脱脂奶粉成本低，但不能用于磷酸化蛋白检测。因为脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，使用脱脂奶粉时，磷酸化抗体可能也会与奶粉中的磷酸化蛋白结合，从而产生高背景。
● 如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。
● 某些抗体用BSA封闭时因不明原因也可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，建议参照抗体说明书进行实验。
（九）一抗的孵育
1. 用WB专用一抗稀释液(对整张膜建议使用5-10ml)，按一定比例(一般为1:1000-1:2000)稀释一抗。
2. 倒掉封闭液，将膜置于适量一抗孵育液中，4℃，水平摇床孵育过夜。
3. 用TBST洗膜，3次，每次5min。
（十）二抗的孵育和洗膜
1. 用WB二抗稀释液按一定比例(HRP标记二抗稀释1:5000-1:10 000；荧光二抗1:10000-1:20000)稀释二抗。
2. 将膜置于二抗孵育液中，水平摇床室温孵育1h。
3. 用TBST洗膜，3次，每次5min。
（十一）目的蛋白质显影
● 化学发光法（使用HRP偶联的二抗）
1. 制备 ECL 工作液：A 液和 B 液等体积的混合，例如0.5ml A 液和0.5ml B 液混合，混匀后即可使用。
2. 用量以充分覆盖印迹膜为准，每10cm2 膜需要大约 1 ml 工作液。
3. 将印迹膜有蛋白的一面朝上平整的铺在一张平板上，加上配好的发光底物工作液。
4. 将工作液均匀滴加在印迹膜上，孵育 1-5 min。可将一洁净的保鲜膜或透明的玻璃纸平整的铺在孵育有工作液的印迹膜上，轻轻赶出其间的气泡。
5. 用合适的照相器材直接记录蛋白膜的化学发光图或使用 X 射线胶片曝光（曝光 5 秒至 1 分钟，通过调整 X 片的曝光时间获得最佳结果）。
● 荧光底物法（使用荧光二抗）
1. 将膜上多余的 TBST 沥干，可使其干燥。
2. 使用合适的荧光扫描仪(如LI-COR Odyssey 荧光成像系统)，根据制造商的建议扫描膜上条带。
四、蛋白免疫印迹(WB)实验常见问题和解决方案
附表1：Bioss常见内参抗体
附表2：Bioss常见蛋白免疫印迹(WB)配套试剂
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