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文献解读|实例分析体外培养类器官的全面检测与评估
发表者:北京博奥森生物      发表时间:2019-7-22


引文

过去几年里,“类器官”(organoids) 这个名词开始逐渐兴起,大家可能听说过它的名字。类器官(organoid) 是能够在实验室中利用人的干细胞培养出的微型器官,与来源组织和器官高度相似。类器官可以说是神奇的“多面手”,它既能够让我们更好地理解机体的发育过程,同时被作为疾病模型协助新药研发,帮助我们治愈疾病。当然,科学家也期待着能够利用类器官替换病人体内受损的组织,用于再生医学。

正文

最近的一篇发表在Nature Methods的报道,采用了一种在毫米流控芯片上(流式培养)体外培养肾器官的方法,该方法扩大了内皮祖细胞的内源性集群,并通过管壁细胞所包围的可灌注腔生成血管网络。为了评估不同培养方式得到的类器官在某一方面的性状和生理功能,常常需要对类器官的各种发育与细胞分化相关标志物进行鉴定。在这篇报道中,研究人员发现具有粘附作用的胞外基质(ECM)比不具有粘附作用的ECM为类器官中的血管发生提供了更好的培养条件,从血管发生相关标志物MCAM、PECAM1以及PODXL的染色情况可以明显观察到两者的效应差异(图1b)。为了评估流式培养肾脏类器官的血管形成情况,研究人员继续观察了在高流体剪切力(FSS)下体外培养的细胞器中MCAM和PECAM 1血管网络在灌注10d后(即分化第21天)中的增强形成(图1 c~e),并随着时间的推移形成了新的肾单位(图1 i~l),提示FSS是促进体外培养肾脏类器官的血管生成的环境因素。

1:在高流体流动下体外培养的肾器官在肾发生过程中表现出增强的血管形成作用。a. 在毫米流控芯片内的工程化的ECM上进行受控于FSS的肾脏类器官的体外培养。分化天数和培养在面板的中部和底部指示条件。未按比例绘制的器官ID。b.对在粘附性或非粘附性ECM上培养的类器官的DNA、MCAM、Pectam1和Podxl等标志物进行染色。比例尺,100μmc~h. FSS下培养的整个器官免疫染色(c~e)和相差显微结果(f~h)的对比图像(第12-21天)。比例尺:50μmc~e)或300μmf~h),灌注方从左至右。i~l,在静态U井、静态工程ECM、低FSS和高FSS条件下培养的类器官整体血管标记的共聚焦3D渲染。比例尺,100μmm. 血管系统的丰度和特征的统计结果,报告为相对于U井培养条件下各个参数的倍数变化。 n. 在各种生长条件下PECAM1表达的定量PCR分析结果

在高FSS情况下,PDGFRβ表达上调(图2e),其中PDGFRβ周细胞样细胞向PECAM 1+网络的募集与血管成熟一致(图2F)。当这些肾器官内的血管在体外进化时,研究人员注意到血管前体和成熟标记物的异质表达,包括灌注10d后的MCAM单阳性、PECAM 1单阳性或MCAMPECAM 1双阳性区域(分化第21天) (图2g)。研究人员观察到无核的开放圆形结构 (DAPI染色阴性),并被MCAM阳性和PECAM 1阳性区域包围,这些区域指示不同直径的器官腔,反映多尺度血管的形成(图2h)。值得注意的是,研究人员观察到暴露于高FSS人多能干细胞 (hPSC) 衍生的肾脏器官 (图2i,j)具有和14.5日龄小鼠肾脏的类似结构(E14.5;图2K)。为了确定全肾器官中可灌注血管的程度,研究人员先在培养基中注入几个小时的荧光微珠(beads),然后在嵌入ECM的细胞器上获得实时共聚焦图像(z-轴堆积)。这些器官随后固定,对PECAM 1进行免疫染色,并与其他标记共染。研究人员观察到荧光微珠出现在与更大的PECAM 1血管相一致的位置(图2 lm)。

2:在体外培养的肾组织中,观察到细胞器内和细胞器间血管网有壁细胞支撑的可灌注腔。a. 肾内皮细胞在体内发育过程中的成熟图,从祖细胞到持续的终末标记表达。b. 培养21天分离的整个类器官的流式细胞分析。EPC为FLK 1阳性细胞群。c.d. 培养第21天内皮细胞标记物的定量PCR分析结果e. 在第21天发育器官中PDGFRβ的定量PCR分析结果 f. PODXL、PECAM 1和PDGFRβ在高FSS下的免疫染色。比例尺,15μM.  g. 内血管标记的类器官整体共聚焦三维染色。比例尺,30μM。白色箭头突出显示的区域是PECAM1+MCAM-h. 图g中的一个z轴图像切片,其中白色箭头突出显示打开的管腔。比例尺,30μM. I~k,透射电镜图像显示在高FSS(I,j) E14.5小鼠胚胎肾脏(k)下,由一层薄膜包裹的圆形开口,反映肾脏器官的血管腔。红色加号显示血管腔。比例尺,10μm (i,k) 2μm(J)。lm,在高FSS下培养的肾脏细胞器底部z轴图像切片,显示血管网(l)和荧光微珠在血管网(m)内的积聚。比例尺,100μMn. 共聚焦3D染色显示桥接的两个相邻的类器官(由虚线白线勾勒)。


研究人员还利用多重血管发生标记物抗体进行免疫荧光染色结合3D共聚焦成像观察体外形成的肾小管极性增强,管状上皮在流动条件下表现出明显的成熟,并经过形态发生,在芯片上的高流量条件下,成为与血管接触的极化纤毛区室(结果未出示)。并且流式培养的肾脏类器官增强重现了在体内的肾小球发育早期阶段的肾小球血管形成和形态发生(结果未出示)。

总而言之,利用发育和细胞分化标志物抗体进行免疫染色并结合多种共聚焦染色技术(如全器官的3D共聚焦染色)对于对类器官的各项进行功能鉴定,是类器官研究的一项重要支撑技术平台,极大地提升了对于类器官发育和功能的分析精度,可以更好地帮助研究人员评估类器官培养方式的有效性。



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