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好的流式数据要选对的标记方案
发表者:北京博奥森生物      发表时间:2018-11-30

细胞在各自正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中,其细胞膜表面均可表达供鉴别的特殊结构,即表面标志。流式细胞术在细胞表面分子的检测与分析主要应用于免疫细胞及其亚群的检测与功能分析;血液系统细胞表面标志的研究;细胞群体及细胞表面标志变化的检测;细胞表面标志构成性质分析。


细胞内或细胞核内染色结合流式细胞术分析确定某些细胞内细胞因子或蛋白表达水平。分析细胞内或细胞核内抗原的关键在于荧光标记的抗体能自由进入细胞内或细胞核内,且不能破坏细胞形态的完整性和保持细胞内靶抗原不变。因此细胞内或核内染色的关键在于细胞固定和胞膜或核膜穿透。


抗原分布位置:

细胞表面抗原:CD分子、趋化因子、整合素、细胞因子受体、Fc受体

细胞内抗原:细胞因子等

细胞核内抗原:增殖细胞核抗原(PCNA)等


流式操作流程



抗体标记方法

1.直接标记法:在一定量细胞悬液中,直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应,加入缓冲液洗涤后,上机检测抗体荧光。

2.间接标记:在一定量细胞悬液中,先加入特异的第一抗体(纯化后的无荧光抗体),待反应完全后洗去未结合抗体,再加入荧光标记的第二抗体,生成抗原—抗体—抗抗体复合物,上机检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。此方法中的荧光来源于二抗。


直接标记与间接标记比较

比较项目

直接标记法 间接标记法

标记步骤

一步 两步

抗体

荧光素偶联抗体 生物素偶联抗体、荧光素偶联SA

应用

常用 多通道分析要求通道搭配时

优点

方法简单、结果准确,易于分析,

多指标共标记(非特异性染色少),

多用于临床标本的检测

放大荧光信号、节约抗体种类,

多用于科研标本的检测

缺点

成本较高

步棸多,细胞易丢失,二抗一般为多克隆抗体,

特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。

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※点击下载Bioss信号转导方向抗体此表格仅展示Bioss可用于流式抗体产品的名称与编号,每种抗体都有以下荧光标记产品Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、AP、APC、Biotin、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、PE、PE-Cy3、PE-CY5、PE-CY5.5、PE-CY7


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