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Bioss讲堂|Western blot内参抗体选择攻略大全
发表者:北京博奥森生物      发表时间:2018-11-19

Western Blot除了能证明某样品中含有某种蛋白之外,其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少——即为蛋白表达水平最直接的证据。要衡量蛋白的表达水平,前提条件就是等量的上样量。内参的意义就是保证上样量的一致。


内参即是内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。


选择内参抗体应遵循的原则

1、样本来源

哺乳动物的组织或细胞:β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等;

植物样本:plant actin、Rubisco 等;

其他来源样本,应参照已发表文献,选择合适蛋白作为内参。

2、目的蛋白定位

全细胞蛋白和细胞质:β-Actin、beta Tubulin、GAPDH 等;

细胞核蛋白:PCNA、LaminA、LaminB、HistoneH3,K70、K80、Erk2、TATAbindingprotein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等;

胞膜蛋白:Na(+)/K(+) ATPase 等;

线粒体蛋白:VDAC1、COXIV等;

血清:Transferrin等。

3、目的蛋白分子量

目的蛋白分子量最好能与内参蛋白分子量相差 5kd 以上,各内参蛋白分子量详见下方汇总表。


Tips: 内参的选择还需要考虑实际的试验环境:

在做多组织多细胞样本对比表达量时,最好选用 GAPDH作为内参,因为GAPDH是代谢类蛋白,在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白,不同组织的细胞结构会有差异性;

而在某些细胞中,由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高,不适合做内参;

涉及细胞增殖的相关试验中,c-Jun由于自身表达变化不适合做内参;

凋亡实验时,TBP、Lamin等也不适合作为内参;

做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时,应选择结构蛋白作为内参,如β-Actin 和β-Tubulin。

做各种分泌液样本的时候,如血浆、乳汁、组织液等,由于没有完整的细胞结构,只能选择一些分泌蛋白作为内参。

设计实验方案的时候应该考虑实际的实验因素并查询相应文献,在实验过程中也应该注意内参表达是否出现异常。


Western Blot内参抗体选择汇总表



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