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Bioss讲堂|IHC之石蜡包埋实操注意要点详解
发表者:北京博奥森生物      发表时间:2018-10-19

本期导读:IHC(Immunohistochemistry, 免疫组织化学)是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测的技术。IHC实验中保护组织的两种主要方法是对组织进行石蜡包埋和冰冻,其中石蜡包埋是制作组织标本最常用、最基本的方法。

石蜡包埋对于组织形态保存完好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;还能长期存档,供回顾性研究。实验组织保护的质量是保证病理报告准确性的重要环节。

本期将介绍石蜡包埋过程中容易忽略,但对实验结果影响很大的实操注意点。


常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤:固定,脱水,透明,浸蜡和包埋

1、固定

取新鲜组织浸泡在4%多聚甲醛或10%福尔马林溶液中固定24-48h。固定完后自来水冲洗五次,各30min。

Tips:

① 组织离体后应在30min之内固定。

② 固定液容积应为组织的5-10倍,固定时间根据组织大小而定,固定时间过长,修复后抗原暴露不完全;时间过短则固定不充分。

③ 脱水机内固定液必须及时更换。

④ 固定后应水洗,否则易造成脱片和染色不新鲜,也不利于蜡块内抗原、基因的保存。


2、脱水

组织经过50%、70%、85%、95%的梯度酒精各30min,无水乙醇两次,每次30min完成脱水。

Tips:

① 未经充分固定的组织不得进去脱水步骤。固定、脱水温度不得超过37℃。

② 用于脱水的试剂容积应为组织总体积的5-10倍以上。

③ 由低向高浓度酒精脱水,级差越小越好,

④ 量大或条件允许,可将大小组织分开脱水,较大组织块脱水时间长与较小者。

⑤ 组织至于无水乙醇内的时间不宜过长,以免硬化。


3、透明

分别经过无水乙醇:二甲苯、二甲苯(Ⅰ)(根据组织透明度,可减少或增加第二遍二甲苯透明的时间)、二甲苯(Ⅱ)各30min。

Tips:

① 二甲苯的容积应为组织总体积的5-10倍以上。

② 透明度时间适宜,依不同种类组织及其大小而异(子宫肌瘤、食管等坚硬组织延长;肝脏,小组织缩短)组织呈现棕黄或暗红色透明即可。

③ 二甲苯应及时过滤、更换。


4、浸蜡

蜡Ⅰ,蜡Ⅱ各30min.

Tips:

石蜡温度控制在58-62℃,高于熔点2℃为佳。


5、包埋

将金属托放入熔化的石蜡,再放入组织,冷固待石蜡凝固。

Tips:

① 防止各种异物组织包入蜡块内。

② 包埋应先放石蜡后放组织,速度尽可能快,以免凝固。

③ 包埋用熔蜡应纯净,熔点与浸蜡的相近。

④ 包埋时不得使用明火,以防点燃,镊子不可温度过高,以免烫伤组织。

⑤ 包一个换一把镊子,防止污染。

⑥ 囊壁、管腔竖直包埋,所需切面向下包埋;扭曲组织正后包埋;多个小组织可以包在一个面。




《IHC/IF/ICC实验方案流程图及所需试剂》


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