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常见问题
免疫组化问题解答
1、染色过强?
原 因
解决方法
抗体浓度过高或孵育时间过长
降低抗体滴度、抗体孵育时间:室温1小时或4度过夜
孵育温度过高超过37度
一般在室温20-28度
DAB显色时间过长或浓度过高
显色时间不超过5-12分钟,以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色?
原 因
解决方法
操作过程中冲洗不充分
每步冲洗3次每次5分钟
组织中含过氧化物酶未阻断
可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长
组织中含内原性生物素
正常非免疫动物血清再封闭
血清蛋白封闭不充分
血清蛋白封闭不充分
3、染色弱?
原 因
解决方法
抗体浓度过低、孵育时间过短
提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用时间
应更换试剂
操作中添加试剂时缓冲液未沥干
每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液
使试剂稀释 (应防止切片干燥)
室温太低,低于15度
要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4度冰箱过夜
蛋白封闭过度
封闭不要超过12分钟
4、染色阴性?
原 因
解决方法
操作步骤错误
应重试,设阳性对照
组织中无抗原
设阳性对照以验证试验结果
一抗与二抗种属连接错误
仔细确定一抗二抗种属无误
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